Overzicht: biofilm en effectieve bestrijding
Biofilm is één van de meest ingewikkelde structuren in de microbiologie en als gevolg daarvan ook zeer moeilijk te bestrijden, zeker met traditionele middelen. In deze blog gaat onze microbioloog Reinoud Homan de diepte in door op wetenschappelijke wijze uiteen te zetten wat biofilm nou echt is en wat je moet doen als antibiotica niet meer helpt.
Biofilm is een bijzonder fenomeen in de natuur. In tegenstelling tot de meeste micro-organismen in onze omgeving is een biofilm waarneembaar met het blote oog. Voorbeelden hiervan zijn een gladde laag op de douchevloer, slijmerige aanslag in een waterleiding en tandplak (zie figuur 1). Ineffectieve bestrijding leidt vervolgens weer tot verregaande problemen als verhoogde antibioticaresistentie onder micro-organismen. In deze blog wordt op gedetailleerde wijze uiteengezet wat biofilm is en wat dit voor effect heeft op mens en dier.
Wanneer er gesproken wordt over microbiologie bedoelt men vaak bacteriën, terwijl het microbiologische spectrum veel breder is. Zo valt te denken aan organismen als algen, protozoa, gisten en schimmels. Veelal onbekend is echter dat deze micro-organismen, evenals grotere organismen, onderdeel uit kunnen maken van complexe bio-structuren in een ecosysteem (1). Een biofilm is zo een structuur; een georganiseerde groep homo- of heterogene micro-organismen die leven binnen een zelf-geproduceerde matrix van exopolysacchariden (EPS) (2).
Biofilms komen voor in vrijwel elke omgeving op aarde dat contact heeft met water; zowel weefsel als vaste en vloeibare oppervlakken (3, 4). Bacteriën kunnen zich door middel van biofilmvorming aanpassen aan omgevingsfactoren (5), zo zijn er biofilms gevonden in extreem zure (pH 1) omgevingen (6) en biedt het vormen van een biofilm bacteriën bescherming tegen onder meer antibiotica (4).
Biofilmformatie
Biofilmformatie gebeurt in vijf stappen: omkeerbare hechting, onomkeerbare hechting, rijpingsstap 1, rijpingsstap 2 en verspreiding (7, 8). Tijdens de eerste stap hechten losse (planktonische) micro-organismen zich aan een oppervlak door fysieke krachten of cellulaire aanhangsels zoals flagella of pili (zie figuur 2) (9). Veel van deze cellen laten ook weer los en zullen geen rol spelen in de biofilm formatie. De tweede stap in het proces wordt gekenmerkt door het contact tussen de micro-organismen. Met behulp van adhesins (zoals exopolysacchariden) wordt een meerlagige biofilm gevormd waarbij de micro-organismen zich aan het oppervlak en aan elkaar hechten (9). Hierdoor kan de biofilm beter weerstand bieden aan externe druk, zoals de stroming van het water.
Vanaf dat moment treedt er een bijzonder effect op: de normaliter solistisch acterende eencellige micro-organismen interacteren en ontwikkelen aangepaste reacties op externe en interne stimuli (10). Dit wordt mogelijk gemaakt door een grote diversiteit aan signaalsystemen, waaronder quorum sensing en secundaire messengers (11). Tijdens de rijping ontwikkelt de biofilm een complexe architectuur, met kanalen, poriën en een radicaal veranderend fenotype: micro-organismen specialiseren zich afhankelijk van hun locatie in de biofilm. In rijpe biofilms van Pseudomonas aeruginosa toont tot 50% van het proteoom minstens een zesvoudig verschil in expressie vergeleken met planktonische cellen (7).
Tijdens de tweede rijpingsstap groeit de microkolonie uit tot een dikte van ongeveer 100 µm. Deze microkolonies bestaan uit verschillende microbiële gemeenschappen die functioneren op een complexe en gecoördineerde wijze. Bijvoorbeeld door middel van substraatuitwisseling, distributie van metabolische producten en de verwijdering van giftige eindproducten (12). In deze rijpingsstap raakt de biofilm aangepast aan de externe omgeving via manipulatie van de structuur, fysiologie en metabolisme.
In de laatste stap verspreidt de biofilm zich en kan het nieuwe plekken koloniseren. De microbiële gemeenschap binnen het biofilm breekt stabiliserende polysacchariden af, waardoor bacteriën bovenop het biofilm vrij worden gelaten (13). Tijdens deze stap wordt de expressie van flagella eiwitten opgereguleerd zodat de losgekomen micro-organismen beweeglijk worden (14). Het zijn weer losse (planktonische) micro-organismen.
Effecten
De formatie van een biofilm biedt micro-organismen veel voordelen in een ongunstige omgeving en een kans op overleving wanneer dat planktonisch niet zou lukken. Biofilms beschermen de micro-organismen tegen onder meer UV straling, pH stress, chemicaliën, fagocytose, dehydratatie en antibiotica (15). De aanwezigheid van biofilms levert in verschillende sectoren verregaande problemen op door de verspreiding van micro-organismen, toxines en andere verbindingen, waaronder infecties via protheses en chronische wonden in de medische sector (16,17), biocorrosie in gas- en oliepijpleidingen (18), tandvleesontsteking en tandbederf in de tandheelkunde (19) en gezondheidsrisico’s in drinkwatersystemen (20).
Veehouderij
In de veehouderij vormt biofilm een enorm risico voor de gezondheid van dieren. Het gebrek aan verplichte controle van de waterkwaliteit op de drinkplek en de getolereerde aanwezigheid van 100.000 bacteriën per milliliter draagt eraan bij dat drinkwater een directe bron van besmetting kan zijn van pathogenen, zoals Brachyspira, E. coli, Salmonella, PED-virus en rotavirus. Ook andere pathogenen beïnvloeden de waterkwaliteit; velen zijn co-infectieus en/of opportuun en van Actinobacillus (APP) en Streptococcen is zelfs bewezen dat ze biofilm kunnen vormen in de waterleiding (21,22).
Bestrijding
De bestrijding van biofilms wordt bemoeilijkt door de weerbaarheid tegen conventionele bestrijdingsmiddelen zoals UV radiatie en antibiotica (zie figuur 3). Daarbovenop kunnen micro-organismen in biofilms een hogere mate van virulentie en pathogeniciteit vertonen dan in planktonische staat, zoals aangetoond bij P. aeruginosa(23). Effectieve strategieën voor de bestrijding van biofilm zijn daarom gebaseerd op het voorkomen van aanhechting van micro-organismen aan een oppervlak en het gebruik van verbindingen die de biofilm formatie kunnen verstoren en/of de gevormde biofilm kunnen ontaarden en afdoden (24,25).
Vanwege de diversiteit aan micro organismen in een biofilm is het dus belangrijk dat een biocide effectief is tegen een breed spectrum van micro-organismen en actief is in het gehele waterleidingsysteem. Een effectief biocide in watersystemen voldoet aan de TNO eisen volgens protocol NEN-EN 13623:2010.
Toevoeging van middelen zoals zuren en chemicaliën zijn daarom vaak geen goede maatregel om biofilms te bestrijden;
- Zuren zijn minder effectief tegen Gram-positieve bacteriën dan Gram-negatieve en creëren zelfs omstandigheden waardoor acidofiele organismen zoals schimmels in de leidingen gaan groeien (26). Bij langdurig gebruik blijkt bovendien dat na een initiële daling van het aantal bacteriën de hoeveelheid op hetzelfde niveau uitkomt als ervoor (27).
- Chlorinatie is ineffectief tegen sommige resistente micro-organismen, waaronder wederom schimmels, en kent andere nadelen als een onprettige smaak en geur, en de synthese van potentieel giftige of mutagene producten zoals trihalomethanen en chloroform (28-31).
- Waterstofperoxide is ineffectief omdat het door veel micro-organismen afgebroken kan worden door middel van catalases (32).
Een goed alternatief zijn elektrochemische desinfectiesystemen ontwikkeld voor waterzuivering. Deze systemen produceren in situ electrochemisch geactiveerd water; vrije chlorides uit een verzadigde zoutoplossing en de directe productie van oxidanten en vrije zuurstofradicalen uit water (33-37). De elektrochemische technologie is effectief tegen een breed spectrum aan micro-organismen, waaronder bacteriën, schimmels virussen en algen en voldoen aan de TNO eisen (28, 38, 39). Andere voordelen zijn milieuvriendelijkheid, veiligheid, lage kosten, gebruiksgemak en altijd een vers product.
Controle
In alle gevallen dient de microbiologische kwaliteit van het drinkwater zowel voor als na de inzet van een biocide gemeten te worden om de effectiviteit aan te tonen. Waterkwaliteit wordt veelal gemeten aan de hand van het totaal aantal kiemen per milliliter en het aantal E. coli per milliliter, maar uitgebreider microbiologisch onderzoek is noodzakelijk om de afwezigheid van andere micro-organismen aan te tonen, zoals bijvoorbeeld schimmels.
Goed drinkwater is vrij van ziekteverwekkers en met gebruik van de huidige testen kan de afwezigheid van biofilm alleen worden gegarandeerd bij de afwezigheid van alle soorten micro-organismen.
R.M. Homan, MSc
Referenties
1. Boltz, Joshua P., et al. "From biofilm ecology to reactors: a focused review." Water Science and Technology 75.8 (2017): 1753-1760.
2. Hurlow J, Couch K, Laforet K, Bolton L, Metcalf D, Bowler P (2015) Clinical biofilms: a challenging frontier in wound care. Adv Wound Care 4(5):295–301
3. Cortes ME, Consuegra J, Sinisterra RD (2011) Biofilm formation, control and novel strategies for eradication. Sci Against Microbial Pathog Commun Curr Res Technol Adv 2:896–905
4. Vasudevan R (2014) Biofilms: microbial cities of scientific significance. J Microbiol Exp 1(3):00014
5. Maric S, Vranes J (2007) Characteristics and significance of microbial biofilm formation. Period Bilogor 109:115–121
6. Edwards KJ, Bond PL, Gihring TM, Banfield JF (2000) An archaeal iron-oxidizing extreme acidophile important in acid mine drainage. Science 287(5459):1796–1799
7. Sauer K, Camper AK, Ehrlich GD, Costerton JW, Davies DG (2002) Pseudomonas aeruginosa displays multiple phenotypes during development as a biofilm. J Bacteriol 184(4):1140–1154
8. Stoodley P, Sauer K, Davies DG, Costerton JW (2002b) Biofilms as complex differentiated communities. Annu Rev Microbiol 56(1):187–209
9. Karatan E, Watnick P (2009) Signals, regulatory networks, and materials that build and break bacterial biofilms. Microbiol Mol Biol Rev 73(2):310–347
10. Bordi C, de Bentzmann S (2011) Hacking into bacterial biofilms: a new therapeutic challenge. Ann Intensive Care 1(1):19
11. Jonas K, Melefors O, Romling U (2009) Regulation of c-di-GMP metabolism in biofilms. Future Microbiol 4(3):341–358
12. Davey ME, O’toole GA (2000) Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol Mol Biol Rev 64(4):847–867
13. Hall-Stoodley L, Costerton JW, Stoodley P (2004) Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol 2(2):95–108
14. Otto M (2013) Staphylococcal infections: mechanisms of biofilm maturation and detachment as critical determinants of pathogenicity. Annu Rev Med 64:175–188
15. Gupta, Priya, et al. "Biofilm, pathogenesis and prevention—a journey to break the wall: a review." Archives of microbiology198.1 (2016): 1-15.
16. Gotz F (2002) Staphylococcus and biofilms. Mol Microbiol 43(6):1367–1378
17. Alhede M, Alhede M (2014) The biofilm challenge. EWMA J 14:1
18. Little, Brenda J., and Jason S. Lee. "Microbiologically influenced corrosion: an update." International Materials Reviews 59.7 (2014): 384-393.
19. Kolenbrander, P. E., Palmer Jr, R. J., Periasamy, S. & Jakubovics, N. S. (2010) Oral multispecies biofilm development and the key role of cell-cell distance. Nat. Rev. Microbiol. 8, 471–480
20. Hallam, N. B., West, J. R., Forster, C. F. & Simms, J. (2001) The potential for biofilm growth in water distribution systems. Water Res. 35 (17), 4063–4071.
21. V.M. Loera-Muro et al. „Detection of Actinobacillus pleuropneumoniae in drinking water from pig farms,” Microbiology, vol. 159, nr. 3, pp. 536-544, 2013
22. C. L. Dawei, „In vitro biofilm forming potential of streptococcus suis isolated from human and swine in china,” Brazilian Journal of Microbiology, vol. 43, nr. 3, pp. 993-1001, 2012
23. Bjarnsholt T (2013) The role of bacterial biofilms in chronic infections. APMIS 121(s136):1–58
24. Yang L, Liu Y, Wu H, Song Z, Hoiby N, Molin S, Givskov M (2012) Combating biofilms. FEMS Immunol Med Microbiol 65(2):146–157
25. Blackledge MS, Worthington RJ, Melander C (2013) Biologically inspired strategies for combating bacterial biofilms. Curr Opin Pharmacol 13(5):699–706
26. P. van der Wolf, „Organische zuren: hoe te gebruiken,” http://edepot.wur.nl/155286.
27. Gezondheidsdienst voor Dieren, „Zuren van de Waterleiding,” http://www.gddiergezondheid.nl/diergezondheid/management/hygiene/zuren-van-de-waterleiding.
28. M. I. Kerwick, S. M. Reddy, A. H. L. Chamberlain en D. M. Holt, „Electrochemical disinfection, an environmentally acceptable method of drinking water disinfection?,” Electrochimica
Acta 50, nr. 50, pp. 5270-5277, 2005
29. R. L. Jolley, L. W. Condie, J. D. Johnson, S. Katz, R. A. Minear, J. S. Mattice en V. A. Jacobs, „Water chlorination: chemistry, environmental impact and health effects,” in Conference on Water Chlorination: Environmental Impact and Health Effects, 6, 1990
30. H. Komulainen, S. L. Vaittinen, T. Vartiainen, J. Tuomisto, V. M. Kosma, E. Kaliste-Korhonen, S. Lötjönen en R. K. Tuominen, „Carcinogenicity of the drinking water mutagen 3-chloro-4-(dichloromethyl)-5-hydroxy-2 (5H)-furanone in the rat,” Journal of the National Cancer Institute, vol. 89, nr. 12, pp. 848-856, 1997
31. A. M. Driedger, J. L. Rennecker en B. J. Mariñas, „Sequential inactivation of Cryptosporidium parvum oocysts with ozone and free chlorine,” Water Research, vol. 34, nr. 14, pp. 3591-3597, 2000
32. A. G. Harris, F. E. Hinds, A. G. Beckhouse, T. Kolesnikow en S. L. Hazell, „Resistance to hydrogen peroxide in Helicobacter pylore: role of catalase,” Microbiology, nr. 148, pp. 3813-3125, 2002
33. W. Liang, .. Qu, L. Chen, H. Liu en P. Lei, „Inactivation of Microcystis aeruginosa by Continuous Electrochemical Cycling Process in Tube Using Ti/RuO2 Electrodes,” Environ. Sci. Technol., vol. 39, nr. 12, pp. 4633-4639, 2005
34. H. Bergman en S. Koparal, „The formation of chlorine dioxide in the electrochemical treatment of drinking water for disinfection,” Electrochimica Acta, vol. 50, nr. 25-26, pp. 5218-5228, 2005
35. A. M. Polcaro, A. Vacca, M. Mascia, S. Palmas, R. Pompei en S. Laconi, „Characterization of a stirred tank electrochemical cell for water disinfection processes,” Electrochimica Acta, vol. 52, nr. 7, pp. 2595-2602, 2007
36. M. Panizza en G. Cerisola, „Application of diamond electrodes to electrochemical processes,” Application of diamond electrodes to electrochemical processes, vol. 51, nr. 2, pp. 191-199, 2005
37. M. H. P. Santana, L. A. De Faria en J. F. Boodts, „Electrochemical characterisation and oxygen evolution at a heavily boron doped diamond electrode,” Electrochimica Acta, vol. 50, nr. 10, pp. 2017-2027, 2005
38. K. Rajeshwar en J. G. Ibanez, Environmental Electrochemistry: Fundamentals and Applications in Pollution Abatement, San Diego, CA, USA: Academic Press, 1997